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江苑生物：慢病毒滴度測(cè)定方法、步驟和原理全攻略

經(jīng)純化和濃縮的慢病毒建議先進(jìn)行滴度測(cè)定，再用于感染目的細(xì)胞。常用的慢病毒滴度測(cè)定方法有4種，分別是：

(1) 熒光計(jì)數(shù)法

(2) 定量PCR法檢測(cè)整合到基因組DNA中的病毒序列

(3) p24蛋白ELISA試劑盒檢測(cè)法

(4) qRT-PCR試劑盒檢測(cè)法檢測(cè)病毒樣本中的基因組拷貝數(shù)

前兩種方法檢測(cè)的是病毒活性滴度，需要用病毒感染細(xì)胞，檢測(cè)過(guò)程一般需要5~10天；后兩種方法檢測(cè)的是病毒的物理滴度（即不能區(qū)分有感染能力的病毒顆粒和無(wú)感染活性的死病毒），可以在1~2天內(nèi)完成。需要說(shuō)明的是：滴度檢測(cè)方法不同，病毒滴度值可能有所差異。

活性滴度：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)?！?/span>TU」為「transducing units」的縮寫(xiě)，中文為「轉(zhuǎn)導(dǎo)單位」，表示可以感染并進(jìn)入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。

若用慢病毒建立普通的過(guò)表達(dá)、敲除和敲降等細(xì)胞系，可以用抗生素或者流式篩選出陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)滴度要求并不嚴(yán)格，測(cè)物理滴度和活性滴度均可。在一些比較嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)中，比如用慢病毒做RNAi-screening或CRISPR-screening，需要嚴(yán)格控制MOI，就需要測(cè)定慢病毒的活性滴度。

1. 熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定滴度的操作方法

(1) 測(cè)定前，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞鋪入96孔板，每個(gè)孔加5×10³個(gè)細(xì)胞，體積為100 μL。（江苑生物用的293T細(xì)胞，也可以使用其他易感染細(xì)胞，如H1299、HT1080細(xì)胞等，但用不同細(xì)胞標(biāo)定的滴度值會(huì)有所差異）。

(2) 感染前，對(duì)待檢測(cè)的病毒樣品進(jìn)行10倍的梯度稀釋。操作方法為：準(zhǔn)備8個(gè)無(wú)菌的EP管，每個(gè)管子中加入90μL細(xì)胞培養(yǎng)基，取待測(cè)定的病毒樣品10 μL加入到個(gè)管中，混勻后，取10 μL加入到第二個(gè)管中混勻，繼續(xù)相同的操作直到最后一管。（每個(gè)梯度可多做復(fù)孔，減少實(shí)驗(yàn)誤差）。

(3) 選取所需的細(xì)胞孔，吸去96孔板中原有的培養(yǎng)基，加入90 μL稀釋好的病毒溶液，并做好標(biāo)記。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，小心操作，不要吹起細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)程中適當(dāng)更換培養(yǎng)基以維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)。

(4) 37℃，5% CO₂培養(yǎng)48小時(shí)后，加入新鮮培養(yǎng)基100 μL，再經(jīng)過(guò)24小時(shí)候，更換新鮮培養(yǎng)基150 μL。（小心操作，避免細(xì)胞被吹起）

(5) 96小時(shí)后，觀察熒光表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)。若病毒本身只帶有Puromycin篩選抗性，則感染后48小時(shí)加入抗性藥物Puromycin，維持藥物濃度在5 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)2天，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，計(jì)算具有抗性的細(xì)胞數(shù)。

滴度的計(jì)算：

用熒光顯微鏡對(duì)熒光陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，數(shù)出最后一個(gè)能觀察到熒光的孔內(nèi)的熒光細(xì)胞數(shù)，熒光細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量即為該病毒的滴度。

根據(jù)下述熒光圖片中GFP表達(dá)情況，在加入10^-6 μL病毒原液的孔中觀察到2個(gè)帶有熒光的細(xì)胞，說(shuō)明該孔中至少有2個(gè)病毒顆粒感染了細(xì)胞，則該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，本例子中就是2/(10^-6)=2×10⁶，單位為TU/μL，也就等于2×10⁹ TU/mL。

該方法還可以用于檢測(cè)帶有Puromycin抗性標(biāo)記的慢病毒的滴度（根據(jù)Puromycin抗性培養(yǎng)基下活細(xì)胞的數(shù)量來(lái)判斷），如果在加入10^-5 μL病毒原液的孔中觀察到3個(gè)細(xì)胞存活，說(shuō)明該孔中至少有3個(gè)病毒顆粒感染了細(xì)胞，則該病毒的滴度等于活的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量，即3/(10^-5)=3×10⁵，單位為 TU/μL，也就等于3×10⁸ TU/mL。

圖1. 一組孔稀釋法滴度測(cè)定過(guò)程中病毒感染293T細(xì)胞后的熒光照片（僅供參考）

2. 定量PCR法檢測(cè)整合到基因組DNA中的病毒序列

(1) 樣品制備

(a) 檢測(cè)前，對(duì)293T細(xì)胞傳代，每個(gè)24孔中加1×10⁵個(gè)細(xì)胞，體積為500 μL；

(b) 按照上述類(lèi)似方法10倍梯度稀釋樣品；

(c) 選取所需的細(xì)胞孔，吸去90 μL培養(yǎng)基。加90 μL入稀釋好的病毒溶液。放入37℃ 5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；留一組不用病毒處理，作為Control組；

(d) 48小時(shí)后，加入新鮮培養(yǎng)基500 μL。小心操作，不要吹起細(xì)胞；

(e) 4天后，抽提RNA準(zhǔn)備做RT-qPCR。

(2) RNA逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA。

(3) 定量PCR檢測(cè)，同時(shí)以Actin作為內(nèi)參基因。

示例: 定量PCR法測(cè)定慢病毒滴度（目的慢病毒中含有GFP基因序列，Control組中不含有GFP序列，檢測(cè)過(guò)程以針對(duì)GFP序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，同時(shí)以Actin作為內(nèi)參），擴(kuò)增曲線圖參見(jiàn)圖2。

圖2. 定量PCR曲線圖（僅供參考）

表1. 定量PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)（僅供參考）

注：曲線顏色和樣品顏色相同

滴度計(jì)算：

通過(guò)比較Control組和試驗(yàn)組的Ct值差異判斷滴度值。Control組無(wú)GFP序列，故Ct值較大。通常情況下，認(rèn)為Ct值差異2以上存在顯著差異。即若試驗(yàn)組Ct值小于Control組Ct值超過(guò)2，則試驗(yàn)組與Control組存在顯著差異，即試驗(yàn)組具有GFP序列。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所獲得的20 μL cDNA中只取了1 μL用于實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，所以該結(jié)果僅表示1/20樣品的情況，所以在滴度計(jì)算時(shí)應(yīng)該乘以系數(shù)20。

在本次滴度檢測(cè)中，10^-5 μL組樣品檢測(cè)到目的基因GFP的表達(dá)，且與Control組間Ct值差異明顯（Ct值相差3左右），所以認(rèn)為在10^-5 μL組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少有1個(gè)病毒顆粒，則病毒的滴度為：

1/(10^-5 μL) ×20＝2×10⁶ TU/μL=2×10⁹ TU/mL

滴度值： >2×10⁹ TU/mL

3. p24蛋白ELSIA試劑盒法測(cè)定慢病毒滴度

檢測(cè)原理：采用固相酶聯(lián)免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測(cè)樣品中的HIV-1 p24抗原。慢病毒樣品中HIV-1 p24抗原與固相抗-p24單克隆抗體和生物素標(biāo)記的抗-p24多克隆抗體通過(guò)免疫反應(yīng)，形成固相抗-p24單克隆抗體—p24抗原—抗-p24多克隆抗體-生物素復(fù)合物；然后加入HRP（Horseradish Peroxidase，辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的鏈親和素，形成固相抗-p24單克隆抗體—p24抗原—抗-p24多克隆抗體-生物素—鏈親和素-HRP復(fù)合物；加入TMB-H₂O₂底物溶液，HRP催化H₂O₂氧化TMB生成藍(lán)色的產(chǎn)物（更大吸收峰655nm），加入終止液終止酶催化反應(yīng)，生成黃色產(chǎn)物（更大吸收峰450nm）。其吸光度與校準(zhǔn)品和樣品中的HIV-1 p24抗原濃度成正相關(guān)。通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線可得出樣品中 HIV-1 p24抗原濃度。

其主要步驟為（詳細(xì)方法參見(jiàn)市售的p24 ELISA試劑盒）：

(1) 樣品準(zhǔn)備和稀釋

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備

(3) 樣品檢測(cè)

(4) 檢測(cè)數(shù)據(jù)分析

值得注意的是，該方法最終得出的樣品中p24蛋白的含量，單位為pg/mL，是物理單位。

要區(qū)別于活性單位TU/mL，因此，采用不同方法檢測(cè)的病毒滴度在病毒感染細(xì)胞時(shí)根據(jù)滴度需要加入的病毒量也有所差異。

4. qRT-PCR試劑盒檢測(cè)病毒樣本中的基因組拷貝數(shù)

檢測(cè)原理：用特異性引物能夠?qū)σ?/span>HIV-1為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的慢病毒樣品的RNA基因組的保守序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，通過(guò)qRT-PCR對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增得到的CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)病毒樣本反應(yīng)的C_T值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到病毒樣本中的RNA 基因組拷貝數(shù)，即病毒顆粒數(shù)（copies/mL）。

關(guān)于qRT-PCR法測(cè)定病毒樣品中RNA的方法操作步驟詳細(xì)請(qǐng)參考對(duì)應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)。