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慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，其感染的顯著特點(diǎn)是感染個(gè)體在出現(xiàn)典型的臨床癥狀之前，大多經(jīng)歷長達(dá)數(shù)年的潛伏期，之后緩慢發(fā)病，因此這些病原體被稱為慢病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括人免疫缺陷病毒（HIV，至少有HIV-1和HIV-2兩個(gè)亞型）、貓免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒（BIV）等。

慢病毒基因組為雙鏈RNA，但區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒具有更廣的宿主范圍，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。重組慢病毒載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的工具載體，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源目的基因所取代，屬于假型病毒（一次性感染能力而無復(fù)制產(chǎn)生新病毒能力）。慢病毒可將靶基因整合到宿主的基因組中，并且能夠在細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)，可以進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選。被廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞系基因敲除、基因過表達(dá)和RNA干擾等。

HIV-1結(jié)構(gòu)

HIV-1 RNA長度約為9 kb，碼了9個(gè)蛋白，分別是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三個(gè)更大的閱讀框編碼了三個(gè)最主要的結(jié)構(gòu)蛋白：gag、pol和env。

gag — 編碼病毒核心蛋白，包括基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白等；             

pol — 編碼病毒復(fù)制所需的酶，如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶；

env — 編碼包膜蛋白，決定病毒感染宿主的靶向性；    

tat — 基因反式激活因子，與病毒的LTRs結(jié)合后促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄；

rev — 病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)gag、pol和env的表達(dá)水平；

vif, vpr, vpu和nef — 4個(gè)輔助因子，編碼的蛋白作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識(shí)別和感染；

 LTR — 長末端重復(fù)序列（long terminal repeat），內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件；病毒基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；對(duì)慢病毒的轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)和整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組都是必須的。

Ψ — 位于5'-LTR和gag基因之間，是病毒基因組二聚化和包裝的必須信號(hào)。

圖1. HIV-1病毒基因組

重組慢病毒系統(tǒng)

重組慢病毒系統(tǒng)是基于HIV-1病毒建立的工具系統(tǒng)，其將HIV-1基因組中的“順式作用元件（如包裝信號(hào)ψ、LTRs）”和“編碼反式作用蛋白的序列（如gag、pol、rev、tet和env等）”進(jìn)行分離，變?yōu)檩d體成分和包裝成分。

“載體成分”包含了HIV-1包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所必須的順式作用元件（LTRs，ψ等），并且兩個(gè)LTRs間插入我們需要表達(dá)的目的序列（目的基因cDNA，shRNA或miRNA等）。

“包裝成分”是去除HIV-1包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列，留下的能編碼反式作用蛋白的序列（如gag、pol、rev、tet和env等），可提供所有的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。出于生物安全性考慮，將慢病毒的反式作用元件gap、pol、rev、env和tet等基因用輔助質(zhì)粒表達(dá)。

慢病毒的包膜蛋白決定了感染細(xì)胞的類型。由于HIV-1病毒的env蛋白只能識(shí)別CD4受體，早期的HIV載體所能感染的宿主范圍非常狹窄。病毒載體可以借助其他病原體的外殼蛋白包裝成假病毒，以改變其嗜性，最常用的是皰疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白（VSV-G）。VSV-G有兩個(gè)明顯的優(yōu)勢：(1) VSV-G蛋白比env蛋白更加穩(wěn)定，因此通過VSV-G蛋白“假型化”的病毒可以進(jìn)行超離濃縮，從而獲得更高的滴度。(2) VSV-G的受體是在細(xì)胞膜上廣泛表達(dá)的磷脂酰絲氨酸，因此相較于env蛋白，VSV-G“假型化”病毒宿主范圍變得更加廣闊。目前，絕大部分慢病毒載體均采用VSV-G作為包膜蛋白。

慢病毒包裝系統(tǒng)

現(xiàn)在常用的包裝系統(tǒng)為第二代慢病毒系統(tǒng)（即三質(zhì)粒系統(tǒng)）和第三代慢病毒系統(tǒng)（即四質(zhì)粒系統(tǒng)）。第二代慢病毒系統(tǒng)含有3個(gè)質(zhì)粒，第三代慢病毒系統(tǒng)含有4個(gè)質(zhì)粒。這兩代病毒系統(tǒng)都含有以下相同的成分：

1，編碼目的序列的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（Transfer Plasmid）。目的序列可以是我們感興趣的目的基因，shRNA或者gRNA-Cas9序列等。Transfer Plasmid其實(shí)就是我們自己構(gòu)建的含有目的序列的慢病毒載體質(zhì)粒。目的序列的兩側(cè)都含有LTR，LTR可以輔助目的序列插入到宿主細(xì)胞的基因組中。通常，病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后整合到宿主基因組中的是LTR之間的序列，包括LTR。慢病毒質(zhì)粒是基于HIV-1病毒改造的，為了安全目的，這些Transfer Plasmids都里不能復(fù)制，并且它們的3'LTR序列有所刪減，這樣病毒插入到基因組后會(huì)自我失活（self-inactivating，SIN）。

2，包裝質(zhì)粒（Packaging Plasmid），編碼病毒的核心蛋白、復(fù)制所需的酶和基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子等。

3，包膜質(zhì)粒（Envelope Plasmid），編碼蛋白質(zhì)外殼。

第二代慢病毒系統(tǒng)：

圖2. 第二代慢病毒系統(tǒng)

這個(gè)系統(tǒng)含有3個(gè)質(zhì)粒：

第1個(gè)質(zhì)粒：包裝質(zhì)粒（Packaging Plasmid），它編碼gag，pol，rev與tat基因。刪除了vif, vpr, vpu和nef 4個(gè)毒力因子，因其對(duì)病毒的致病性是必須的，但去除后不影響病毒的滴度和感染能力。

第2個(gè)質(zhì)粒：包膜質(zhì)粒（Envelope Plasmid），含有VSV-G序列（用以替換env序列），編碼包膜蛋白。

第3個(gè)質(zhì)粒：轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（Transfer Plasmid），含有病毒的LTRs和Ψ包裝信號(hào)（圖片未畫出），除非有內(nèi)部啟動(dòng)子，否則這個(gè)Transfer Plasmid的目的序列是由5'LTR驅(qū)動(dòng)的，它是一個(gè)弱啟動(dòng)子，需要Tat元件激活。所有的第2代慢病毒Transfer Plasmid必須要用第2代慢病毒包裝系統(tǒng)，因?yàn)樗?/span>LTR是Tat依賴性的。而第3代慢病毒包裝系統(tǒng)不能包裝第二代Transfer Plasmid，因?yàn)椴槐磉_(dá)Tat。

第三代慢病毒系統(tǒng)：

圖3. 第三代慢病毒系統(tǒng)

設(shè)計(jì)第3代慢病毒系統(tǒng)的目的主要還是提高安全性。第3代慢病毒系統(tǒng)，將第2代慢病毒系統(tǒng)的Packaging Plasmid分成了2個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)編碼rev，另外一個(gè)編碼gag和pol。雖然第3代慢病毒包裝系統(tǒng)更為安全，但使用時(shí)更麻煩，并且由于添加了一個(gè)額外的質(zhì)粒導(dǎo)致它的效率降低了。除此之外，第3代慢病毒包裝系統(tǒng)刪除了Tat元件，并且Transfer Plasmid 5'LTR被部分刪除并融合上異源增強(qiáng)子/啟動(dòng)子（如CMV或者RSV啟動(dòng)子），該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的序列表達(dá)并不依賴于Tat元件。第3代病毒的Transfer Plasmid可以使用第2代或第3代的包裝質(zhì)粒。

注意：第三代慢病毒包裝系統(tǒng)只能包裝第三代慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，但是第二代慢病毒包裝系統(tǒng)既能包裝第二代，也能包裝第三代慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。

第二代慢病毒系統(tǒng)與第三代慢病毒系統(tǒng)的區(qū)別

常用包裝質(zhì)粒總結(jié)

包裝步驟

詳見慢病毒包裝試劑盒（江苑生物 JY03021）說明書。